Качественные биопрепараты
для научных и клинических
исследований
Культивирование клеток (2D)
Содержание
- Введение
- Растворы
- Приготовление смеси растворов коллагена, культуральной среды и суспензии клеток. Образование геля
- Возможные проблемы и способы их решения
Введение
Культивирование эукариотических клеток на поверхности пластиковых либо стеклянных подложек является стандартным методом ведения культуры in vitro. Тем не менее, большинство клеток in vivo существует внутри внеклеточного матрикса, составляя с последним ткани и только в такой форме выполняя свойственные им функции. Для моделирования естественного поведения клеток in vitro необходимо помещать их в трехмерные структуруы на основе коллагена. Это позволяет не только изучать морфологические и физиологические особенности эукариотических клеток, но и создавать искусственные ткани для применения в регенеративной медицине.
Растворы
- Стерильный раствор коллагена I типа в уксусной кислоте 5 мМ. Концентрация коллагена 10 мг/мл.
- Cреда для культивирования клеток с добавлением фетальной сыворотки
- Стерильный раствор бикарбоната натрия 0,9 М
Приготовление смеси растворов коллагена, культуральной среды и суспензии клеток
Данный протокол является типовым. Оптимальные условия (например, концентрация коллагена в гидрогеле) необходимо подбирать для каждой конкретной культуры клеток и задачи эксперимента. Для приготовления 1 мл геля с концентрацией коллагена 2 мг/мл необходимо:
1) К 0,75 мл культуральной среды (полной, с добавлением фетальной сыворотки) добавить 0,20 мл раствора коллагена (10 мг/мл), быстро перемешать пипетированием, избегая образования пузырей. Добавление вязкого раствора коллагена к раствору культуральной среды следует производить при помощи шприца объемом 1 мл без иглы, поскольку автоматическая пипетка с наконечником не обеспечит точного дозирования. Для успешного гелеобразования pH полученного раствора должен быть в пределах 7,0-7,5, о чем свидетельствует красный цвет индикатора культуральной среды (феноловый красный). Если цвет индикатора желтый, то буферной емкости культуральной среды не хватило для титрования кислого раствора коллагена и необходимо дополнительное титрование. Для этого используется концентрированный раствор бикарбоната натрия (см. п. 2).
2) Опционально. Добавить к смеси коллагена и культуральной среды 10-20 мкл 0,9 М стерильного раствора бикарбоната натрия и тщательно перемешать пипетированием, избегая образования пузырей. Если цвет среды стал красным, значит pH раствора сместился в нейтральную зону. Если цвет среды стал малиновым, значит pH среды сместился в щелочную зону и необходимо уменьшение количества бикарбоната натрия. Обычно достаточно 10-20 мкл раствора бикарбоната натрия на 1 мл смеси.
3) Добавить к смеси необходимое количество клеток в объеме культуральной среды 30-40 мкл, перемешать, держа пробирку в ледяной бане и избегая образования пузырей. Поместить полученную смесь в лунку планшета (0,3-1 мл/лунку 24-л. планшета или 0,03-0,1 мл/лунку 96-л. планшета) и инкубировать в течение 15-30 мин в СО2-инкубаторе при 37°С.
4) На поверхность сформированного геля наслоить 300-500 мкл (24-л. планшет) или 100-120 мкл (96-л. планшет) культуральной среды. Производить смену среды согласно регламенту ведения конкретной культуры. Не следует превышать указанный объем культуральной среды над поверхностью геля – это может повлиять на жизнеспособность клеток. В случае, когда планируется исследовать поведение клеток на поверхности геля и/или их миграцию внутрь геля, следует сформировать гель без добавления клеток, а затем добавить суспензию клеток в культуральной среде поверх геля.
Возможные проблемы и способы их решения
- Введение
- Растворы
- Приготовление смеси растворов коллагена, культуральной среды и суспензии клеток. Образование геля
- Возможные проблемы и способы их решения
Введение
Культивирование эукариотических клеток на поверхности пластиковых либо стеклянных подложек является стандартным методом ведения культуры in vitro. Тем не менее, большинство клеток in vivo существует внутри внеклеточного матрикса, составляя с последним ткани и только в такой форме выполняя свойственные им функции. Для моделирования естественного поведения клеток in vitro необходимо помещать их в трехмерные структуруы на основе коллагена. Это позволяет не только изучать морфологические и физиологические особенности эукариотических клеток, но и создавать искусственные ткани для применения в регенеративной медицине.
Растворы
- Стерильный раствор коллагена I типа в уксусной кислоте 5 мМ. Концентрация коллагена 10 мг/мл.
- Cреда для культивирования клеток с добавлением фетальной сыворотки
- Стерильный раствор бикарбоната натрия 0,9 М
Приготовление смеси растворов коллагена, культуральной среды и суспензии клеток
Данный протокол является типовым. Оптимальные условия (например, концентрация коллагена в гидрогеле) необходимо подбирать для каждой конкретной культуры клеток и задачи эксперимента. Для приготовления 1 мл геля с концентрацией коллагена 2 мг/мл необходимо:
1) К 0,75 мл культуральной среды (полной, с добавлением фетальной сыворотки) добавить 0,20 мл раствора коллагена (10 мг/мл), быстро перемешать пипетированием, избегая образования пузырей. Добавление вязкого раствора коллагена к раствору культуральной среды следует производить при помощи шприца объемом 1 мл без иглы, поскольку автоматическая пипетка с наконечником не обеспечит точного дозирования. Для успешного гелеобразования pH полученного раствора должен быть в пределах 7,0-7,5, о чем свидетельствует красный цвет индикатора культуральной среды (феноловый красный). Если цвет индикатора желтый, то буферной емкости культуральной среды не хватило для титрования кислого раствора коллагена и необходимо дополнительное титрование. Для этого используется концентрированный раствор бикарбоната натрия (см. п. 2).
2) Опционально. Добавить к смеси коллагена и культуральной среды 10-20 мкл 0,9 М стерильного раствора бикарбоната натрия и тщательно перемешать пипетированием, избегая образования пузырей. Если цвет среды стал красным, значит pH раствора сместился в нейтральную зону. Если цвет среды стал малиновым, значит pH среды сместился в щелочную зону и необходимо уменьшение количества бикарбоната натрия. Обычно достаточно 10-20 мкл раствора бикарбоната натрия на 1 мл смеси.
3) Добавить к смеси необходимое количество клеток в объеме культуральной среды 30-40 мкл, перемешать, держа пробирку в ледяной бане и избегая образования пузырей. Поместить полученную смесь в лунку планшета (0,3-1 мл/лунку 24-л. планшета или 0,03-0,1 мл/лунку 96-л. планшета) и инкубировать в течение 15-30 мин в СО2-инкубаторе при 37°С.
4) На поверхность сформированного геля наслоить 300-500 мкл (24-л. планшет) или 100-120 мкл (96-л. планшет) культуральной среды. Производить смену среды согласно регламенту ведения конкретной культуры. Не следует превышать указанный объем культуральной среды над поверхностью геля – это может повлиять на жизнеспособность клеток. В случае, когда планируется исследовать поведение клеток на поверхности геля и/или их миграцию внутрь геля, следует сформировать гель без добавления клеток, а затем добавить суспензию клеток в культуральной среде поверх геля.
Возможные проблемы и способы их решения
|
Проблема |
Возможная причина и решение |
|
Наблюдаются участки локального гелеобразования во время смешивания стоковых растворов, в результате чего конечный гель имеет неоднородную структуру |
Стоковые растворы хранились при комнатной температуре. Необходимо использовать холодные стоковые растворы (4-8°С) |
|
При смешивании всех растворов индикатор среды (феноловый красный) желтого или малинового цвета |
Необходимо увеличить или уменьшить соответственно количество добавляемого раствора бикарбоната натрия. |